Υποστήριξη Διδακτορικής Διατριβής - Βασίλης Ανδριόπουλος

Τα μικροφύκη έχουν μελετηθεί εκτενώς από βιολόγους για τουλάχιστον 80 χρόνια, ενώ τις τελευταίες δεκαετίες προσέλκυσαν το ενδιαφέρον των βιοτεχνολόγων λόγω του υψηλού ρυθμού ανάπτυξής τους και της ελκυστικής βιοχημικής τους σύστασης, η οποία, ανάλογα με το είδος και τις συνθήκες καλλιέργειας, μπορεί να είναι κατάλληλα για την παραγωγή καυσίμων, τροφίμων ή ζωοτροφών ή φαρμακευτικών και καλλυντικών προϊόντων. Ενώ αρχικά τα βιοκαύσιμα ήταν το κύριο επίκεντρο της έρευνας για τα μικροφύκη, πρόσφατα το ενδιαφέρον για αυτόν τον τομέα έχει μειωθεί, με τα τρόφιμα, τις ζωοτροφές και τις φαρμακευτικές ή καλλυντικές εφαρμογές να παίρνουν τη θέση του. Μια κατηγορία μορίων που έχει αναφερθεί σε μικροφύκη μόνο τα τελευταία 20 χρόνια είναι οι φαινολικές ενώσεις. Χαρακτηρισμένη τόσο με ποσοτικές όσο και με ποιοτικές τεχνικές, αυτή η κατηγορία μορίων έχει τη δυνατότητα να καταστήσει πιο εφικτή τη βιοδιυλιστήριο μικροφυκών, εισάγοντας ένα επιπλέον προϊόν υψηλής αξίας μαζί με τις χρωστικές και τα ωμέγα-3 λιπαρά οξέα. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να μελετήσει την παραγωγή φαινολικών και άλλων αντιοξειδωτικών από επιλεγμένα θαλάσσια μικροφύκη, διατηρώντας ταυτόχρονα υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες και ωμέγα-3, κατάλληλα για τρόφιμα ή ζωοτροφές. 

Τα επιλεγμένα θαλάσσια είδη ήταν τα Chlorella minutissima, Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana και Tisochrysis lutea, τα οποία είχαν ελκυστικό φαινολικό περιεχόμενο καθώς και θρεπτική σύνθεση βιομάζας σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Το πρώτο βήμα ήταν η εξέταση της σύνθεσης βιομάζας και της περιεκτικότητας σε φαινολικά συστατικά αυτών των ειδών. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια υπό συνθήκες κορεσμού σε φως και ελεγχόμενη θερμοκρασία (25°C), ενώ η βιομάζα συλλέχθηκε σε δύο στάδια, την πρώιμη και την όψιμη στατική φάση. Το C. minutissima και το N. oculata παρουσίασαν τους υψηλότερους ρυθμούς ανάπτυξης, ενώ όλα τα μικροφύκη ήταν πλούσια σε πρωτεΐνη. Μόνο το N. oculata περιείχε C20:5n3 (EPA) σε σημαντική ποσότητα, ενώ μόνο το I. galbana και το T. lutea περιείχαν C22:6n3 (DHA). Η βιομάζα όλων των ειδών εκχυλίστηκε διαδοχικά με νερό και μεθανόλη για να εκτιμηθεί η περιεκτικότητά της σε αντιοξειδωτικά. Ενώ το μεθανολικό εκχύλισμα του C. minutissima ήταν το πιο ισχυρό όσον αφορά την μέθοδο Folin-Ciocalteau, μια ποσοτική μέθοδο για τη μέτρηση των φαινολικών σε φυτικά δείγματα, η χρωματογραφική ανάλυση έδειξε πλήρη απουσία φαινολικών από όλα τα δείγματα, με εξαίρεση μικρές κορυφές στα εκχυλίσματα T. lutea. Το συμπέρασμα ήταν ότι χρωστικές όπως η χλωροφύλλη μπορεί να έχουν σημαντική παρεμβολή στην μέθοδο FC, ενώ η σύνθεση βιομάζας των N. oculata καιT. lutea είναι υποσχόμενη για την παραγωγή θρεπτικής βιομάζας και εκχυλισμάτων χρωστικών και ωμέγα-3 FA.

Για την περαιτέρω διερεύνηση της δυνατότητας παραγωγής αντιοξειδωτικών από N. oculata και T. lutea μελετήθηκαν διαφορετικοί στρεσογόνοι παράγοντες, συγκεκριμένα η αλατότητα, η ένταση του φωτός και η έλλειψη αερισμού. Χρησιμοποιήθηκε ένας κλασματικός παραγοντικός σχεδιασμός με δύο επίπεδα, με εφαρμογή αλατότητας 38 και 60 ppt και αερισμό 2.4 ή 0 vvm, ενώ τα επίπεδα έντασης φωτός ήταν διαφορετικά για τα δύο είδη λόγω των διαφορετικών ανοχών τους. Σημαντικές επιδράσεις της έλλειψης αερισμού αποκαλύφθηκαν για το N. oculata, με αύξηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη και μείωση της περιεκτικότητας σε κορεσμένα FA, ενώ η φαινομενική περιεκτικότητα σε φαινολικά σύμφωνα με την μέθοδο FC αυξήθηκε επίσης, χωρίς συσχέτιση με τις χρωστικές. Αντίθετα, το T. lutea δεν παρουσίασε θετικές επιδράσεις υπό συνθήκες στρες, ενώ η φαινομενική περιεκτικότητά του σε φαινολικά συστατικά ποικίλλει ανάλογα με την περιεκτικότητα σε χρωστική ουσία. Συμπερασματικά, η έλλειψη αερισμού μπορεί να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τη βελτιστοποίηση της καλλιέργειας του N. oculata, ενώ απαιτείται περαιτέρω έρευνα για τις ενώσεις που συμβάλλουν στην αντιοξειδωτική του δράση. 

Το επόμενο βήμα ήταν να βελτιστοποιηθούν οι κρίσιμες παραμέτροι καλλιέργειας, συγκεκριμένα η θερμοκρασία, το pH, η περίοδος φωτός και η αναλογία φωτισμένης επιφάνειας προς όγκο, για την παραγωγή θρεπτικής βιομάζας και αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος από το N. oculata. Παράλληλα αναπτύχθηκε πρωτόκολλο εκχύλισης σε συνεργασία με το Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων (LPCNP), Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. Όπως και πριν, υιοθετήθηκε μια κλασματική παραγοντική προσέγγιση, ενώ πραγματοποιήθηκαν δύο σειρές πειραμάτων, μια σε φωτοβιοαντιδραστήρες με αυτόματο έλεγχο του pH μέσω προσθήκης οξέος ή βάσης και μία σε κωνικές φιάλες με καθημερινή ρύθμιση του pH σε μία προκαθορισμένη τιμή. Γραμμική παλινδρόμηση στα συνδυασμένα δεδομένα από τα δύο πειράματα έδειξε επιδράσεις θερμοκρασίας και έντασης φωτός που συμφωνούν με τη βιβλιογραφία, για παράδειγμα τις αρνητικές επιδράσεις των δύο αυτών παραμέτρων στο κλάσμα EPA στα συνολικά λιπίδια, ενώ μια πιο ελκυστική σύνθεση βιομάζας επιτεύχθηκε σε φωτοβιοαντιδραστήρες, οι οποίοι είχαν χαμηλότερη αναλογία φωτισμένης επιφάνειας προς όγκο, σε βάρος του υψηλότερου ρυθμού ανάπτυξης. Μεταξύ των μεθόδων εκχύλισης που αξιολογήθηκαν από το LPCNP, επιλέχθηκε η αιθανολική εκχύλιση με τη βοήθεια υπερήχων, λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη της υπολειμματικής βιομάζας και της υψηλής περιεκτικότητας σε χρωστική και EPA των εκχυλισμάτων. Η υφή πούδρας και η πρακτικά μηδενική περιεκτικότητα σε υγρασία της υπολειμματικής βιομάζας μετά την λιοφιλίωση ήταν επίσης πολύ ελκυστικά χαρακτηριστικά για βιομηχανική χρήση, όπως η ενσωμάτωση σε προϊόντα διατροφής. Η χρήση της επιλεγμένης μεθόδου εκχύλισης στη βιομάζα από τα πειράματα βελτιστοποίησης έδειξε μια ενδιαφέρουσα επίδραση της θερμοκρασίας, με υψηλότερη περιεκτικότητα σε χρωστικές σε εκχυλίσματα βιομάζας που καλλιεργήθηκε σε υψηλή θερμοκρασία παρά την χαμηλότερη περιεκτικότητα αυτής της βιομάζας σε χρωστικές. Αυτό θα μπορούσε να σχετίζεται με ένα εξασθενημένο κυτταρικό τοίχωμα ή με μια τροποποιημένη συσσώρευση χρωστικών ουσιών στον χλωροπλάστη και απαιτεί περαιτέρω εξέταση. Η παράλληλη βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας για υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες και βιομάζα EPA καθώς και για υψηλή περιεκτικότητα σε εκχύλισμα χρωστικής, έδειξε ότι η καλλιέργεια σε θερμοκρασία 20-27.5°C, 16-18 ώρες φωτός και pH ~ 7.7 σε φωτοβιοαντιδραστήρες θα απέδιδε βιομάζα με περιεκτικότητα πρωτεΐνης 40-60% και EPA 3.2-4.5 % επί του ελεύθερου τέφρας ξηρού βάρους (AFDW), που παράγει εκχύλισμα με τουλάχιστον 386 mg Chla και 86 mg καροτενοειδή L^-1.

Πραγματοποιήθηκε περαιτέρω διερεύνηση των επιδράσεων των συνθηκών καλλιέργειας στην περιεκτικότητα και το προφίλ σε λιπαρά οξέα στο N. oculata, χρησιμοποιώντας νέα δεδομένα από διάφορα συστήματα καλλιέργειας και τη διαθέσιμη βιβλιογραφία. Μια νέα μέθοδος παλινδρόμησης, ο αλγόριθμος επιλογής υψηλών διαστάσεων με αλληλεπιδράσεις, επιστρατεύτηκε για την αξιολόγηση ενός πολύ μεγάλου αριθμό παραμέτρων και των αλληλεπιδράσεων τους, κάτι που δεν θα ήταν δυνατό με κλασσική παλινδρόμηση ελαχίστων τετραγώνων. Τα ευρήματα επιβεβαίωσαν πολύ γνωστές επιδράσεις όπως αυτές της θερμοκρασίας, ενώ λιγότερο μελετημένες επιδράσεις όπως αυτή του καλίου στο παλμιτικό οξύ επιβεβαιώθηκαν επίσης, παρά την απουσία μελετών που σχετίζονται με το κάλιο στα δεδομένα εκπαίδευσης. Το πιο σημαντικό νέο αποτέλεσμα ήταν αυτό του αερισμού στο κλάσμα ΕΡΑ στα ολικά λιπίδια. Η απουσία αερισμού μπορεί να τροποποιήσει την περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα, μειώνοντας τα κορεσμένα FA ενώ διατηρείται σταθερή η περιεκτικότητα σε EPA στη βιομάζα. Απαιτείται περισσότερη έρευνα για να διαχωριστούν οι επιδράσεις του αερισμού από αυτές της ανάμειξης και να διευκρινιστεί εάν η αύξηση του οξυγόνου σε μη αεριζόμενες συνθήκες ενισχύει τον αποκορεσμό των λιπαρών οξέων. Η επικύρωση των μοντέλων με εξωτερικά δεδομένα έδειξε καλή απόδοση των μοντέλων για ολική περιεκτικότητα σε λιπίδια και κλάσμα EPA σε ολικά λιπίδια υπό σταθερές συνθήκες, ενώ σε υπαίθριες συνθήκες η περιεκτικότητα σε EPA υποεκτιμήθηκε, με τη συνολική τάση ωστόσο να έχει προβλεφθεί σωστά. Ο εμπλουτισμός του συνόλου δεδομένων εκπαίδευσης θα πρέπει να είναι στόχος για μελλοντική βελτίωση. Η βελτιστοποίηση έδειξε μια μεγάλη προοπτική του N. oculata για την παραγωγή EPA, με έως και ~ 11% AFDW EPA στην βιομάζα και 0.12 g L^-1 EPA να επιτυγχάνεται υπό βέλτιστες συνθήκες, ενώ η έλλειψη αερισμού μπορεί να είναι εξοπλισμένη για τη μείωση των κορεσμένων FA και την επίτευξη πιο ελκυστικού διατροφικού προφίλ της βιομάζας. 

Ως τελικό βήμα, επανεξετάστηκε το φαινολικό περιεχόμενο των μικροφυκών. Η αξιολόγηση της βιβλιογραφίας σχετικά με την περιεκτικότητα σε φαινολικά μικροφύκια σύμφωνα με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau και τη χρωματογραφική ανάλυση έδειξε αρκετά προβλήματα με τα αναφερόμενα ευρήματα και τη μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε. Από τη μία πλευρά, η παρεμβολή χρωστικών, ελεύθερων αμινοξέων και νουκλεοτιδίων στον προσδιορισμό FC έχει σχεδόν ολικά παραμεληθεί, ενώ οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί των κυττάρων όπως το σύστημα γλουταθειόνης έχουν μελετηθεί σε κάποιο βαθμό αλλά όχι και η επίδρασή τους στην μέθοδο FC. Από την άλλη πλευρά, οι χρωματογραφικές ενδείξεις για φαινολικές ουσίες στα μικροφύκη μπορεί να διακυβεύονται από μόλυνση από εξωτερικές πηγές μέσω προσρόφησης στο κυτταρικό τοίχωμα ή απορρόφησης και βιομετατροπής από τα κύτταρα. Η έλλειψη δύο κρίσιμων ενζύμων που εκκινούν το μονοπάτι του φαινυλοπροπανοειδούς (PP) από τα περισσότερα μικροφύκη καθιστά επίσης αινιγματική την παρουσία κινναμωμικών οξέων, ανθοκυανινών και άλλων προϊόντων του ΡΡ. Αποκλεισμός των φαινολικών από όλα τα μέσα ανάπτυξης και οι λεπτομερώς αναφερόμενες μέθοδοι θα πρέπει να εφαρμοστούν σε μελλοντικές έρευνες, ενώ η απομάκρυνση των φαινολικών από τα ρεύματα αποβλήτων από τα μικροφύκη είναι πολλά υποσχόμενη. 

Συμπερασματικά, το N. oculata είναι υποσχόμενο για την ανάπτυξη ενός βιοδιυλιστηρίου βασισμένου σε αιθανολικό εκχύλισμα πλούσιο σε χρωστικές, EPA και πιθανώς άλλα αντιοξειδωτικά και υπολειμματική βιομάζα με εξαιρετική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη και υπολειπόμενο EPA, ενώ η έλλειψη αερισμού μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω ως τελικό βήμα για τη βελτίωση της περιεκτικότητας σε λιπαρά οξέα. Η περιεκτικότητα των μικροφυκών σε φαινολικά ίσως να μην παρουσιάζει πρακτικό ενδιαφέρον, λαμβάνοντας υπόψη την αφθονία των ροών φυτικών αποβλήτων πλούσιων σε φαινολικές ουσίες, παράλληλα όμως η απομάκρυνση φαινολικών από τα μικροφύκη είναι πολλά υποσχόμενη, ενώ η διέγερση των μικροφυκών από φαινολικά είναι επίσης ένα ενδιαφέρον ερευνητικό θέμα.